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1945年4月，苏中军民经过8年艰苦的抗日战争，迎来抗日大反攻的新形势。日军苦于兵力不足，为了阻止苏中军民的战略反攻，命令盘踞在宝应县城的伪苏北绥靖公署特务第二团马佑铭部，调往兴化以南的周庄驻防。4月20日，打入敌人内部的新四军敌工人员将这一情报向十八旅旅长刘飞进行了汇报。刘飞等人对敌情做了研究后，认为可以在敌调防途中将其歼灭，并迅速将这一方案向苏中军区司令员管文蔚、政委陈丕显作了汇报，军区立即批准这一计划，并调集十八旅五十二团、江都独立团、三分区特务五团、一分区特务营等部划归刘飞统一指挥。

刘飞随即带领侦察人员勘察，发现三垛镇至河口镇之间有条东西走向的公路，5公里内没有树木遮蔽，路北是泥泞的水田，路南是与公路平行的北澄子河，视野开阔，且这里位于兴化、高邮的中间地带，与两城均相距40里，不利于敌人增援。于是，刘飞决定把伏击地点设在三垛镇以东、北澄子河边新庄到野徐庄一线约3.5千米的狭长地带，并命令江都独立团埋伏于河口镇以西，控制通往兴化的公路和河道，阻住敌人水路前进道路；一分区特务营待敌人通过后，封锁敌人回逃之路，并阻击从高邮出援之敌；五十二团主力埋伏在公路以北，待敌人进入伏击圈后出击，将敌人分割；三分区特务五团会同独立团一个连守卫河南，严防敌人渡河南逃，随时准备渡河歼敌；旅指挥所设在河南岸的民房内。

4月25日下午，换防敌人离开驻地向高邮移动，沿途新四军和地方干部布下的侦察人员随时将敌人的行进情况报给旅指挥所。4月27日拂晓，新四军各参战部队秘密开进阵地。

28日早上，敌人离开高邮城，隐蔽在高邮县城外的高邮独立团立即用电台向指挥所报告了敌人行踪。当日中午，敌人进入三垛镇，午后2时，敌人从三垛镇出发，一路向伏击圈走来：最前方是日军1个小队，随后是伪军1500余人，再次是日军两个中队300余人，后卫是伪军一个营；另有3艘汽艇，拖着民船20余只，满载辎重并日军50余人、伪军200余人，与陆上部队并进。前方的日军小队行至野徐庄后，被公路上一条约5米宽的沟拦住了去路。由于几天来天降暴雨，河水猛涨，水面几乎接近了地面，导致沟中积满了雨水。敌人前卫无法通过，又没有架桥材料和工具，无奈之下只好联络河里的敌人，让他们腾出木船搭建浮桥，此时，后面的敌人也陆续赶到，公路上顿时混乱起来。

刘飞一声令下，新四军指战员从四面开火，子弹、炮弹如暴雨般射向敌群。战斗一打响，伪团长马佑铭就被一发炮弹击中负重伤而从马上掉下来，一个日军中队长也被新四军机枪火力击毙，日伪军顿时成了乌合之众，加上公路上没有什么隐蔽物可以利用，敌人在新四军的火力打击下顿时死伤狼藉。战斗中，敌人的三艘汽艇扔下木船，企图开足马力突出重围，但螺旋桨被新四军事前投入河中的大批草绳缠住，在河里打转。艇上的敌人纷纷跳进水里，企图游水逃向岸上，遭到埋伏在两岸的新四军战士猛烈射击。岸上的日军见状，跑到河边准备下水救援，两脚陷入河床的淤泥，也成了南岸新四军的活靶子。

见敌人队形被打乱，刘飞命令各伏击部队发起冲锋，位于北澄子河南的新四军也渡河冲上公路，迅速把公路上的日伪军截成数段分割包围起来。在“缴枪不杀”的呐喊声中，被围伪军在副团长的带领下纷纷缴械投降，公路东段的战斗仅用一个半小时就基本结束。

殿后的日军一个中队和伪军一个营发现向西逃回高邮的路被新四军特务营切断，便仓皇向新庄跑去，企图凭借房屋固守待援。五十二团迅速组织力量冲入敌人阵地，和敌人展开巷战，把残敌逐步压缩到村子的南部。随后，新四军各部相继赶到新庄，向残敌猛攻，歼敌大半，日军只剩30余人。天黑后，敌人援军相继赶到，鉴于伏击战的目的已经达成，为保持主动，新四军除以部分兵力继续攻击、监视新庄内的残敌外，大部分参战部队在打扫战场后撤出战场。三垛河口伏击战至此胜利结束。

三垛河口伏击战是新四军苏中地区继车桥战役后的又一次大捷。据统计，此次战斗给日伪军以沉重打击，共歼日伪军1800多人，其中击毙日军240多人、伪军600多人，俘虏日军7人、伪军团长马佑铭以下伪军958人，缴获曲射炮两门、掷弹筒及小炮12门、轻重机枪24挺、步枪1166支、短枪48支，枪弹5万余发，电台3部。战后，新四军军部对参战指战员进行了通令嘉奖。